细胞钙离子荧光探针(Fluo-4,AM)

产品货号：

SY0554

中文名称：

细胞钙离子荧光探针(Fluo-4,AM)

英文名称：

Fluo-4, AM, Cell Permeant

产品规格：

50μg|5×50μg|1mg

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1～3天

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细胞生物学实验中常使用Fluo-3,AM作为一种荧光探针来检测细胞内钙离子浓度变化。其检测原理基于Fluo-3,AM可穿透细胞膜进入细胞，之后被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。Fluo-3游离配体几乎是非荧光性的，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。但是，当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，荧光会增加60至80倍。

Fluo-4,AM是钙指示剂Fluo-3,AM的升级版本，主要变化为后者分子上的两个氯原子被Fluo-4,AM上的氟所取代，该结构上的微小变化使Fluo-4,AM加载更快，在相同浓度下检测信号更强。本Fluo-4,AM粉末状，用于细胞内钙离子检测时，Fluo-4,AM的常用浓度为0.5～5μM。

CAS号	273221-67-3
分子式	C₅₁H₅₀F₂N₂O₂₃
分子量	1096.94
光谱特性	Ex/Em=494nm/516nm，Ca²⁺-bound
纯度	≥90%
外观	橙红色粉末
结构式

组分	50μg	5×50μg	1mg
细胞钙离子荧光探针(Fluo-4,AM)	50μg	5×50μg	1mg
说明书	1份

保存：-20℃干燥避光，有效期一年。

注意事项

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
本Fluo-4,AM容易吸潮，从冰箱取出后，请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
第一次使用时，建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用，以保证实验效果。
母液遇水极易分解，如果不能一次用完，建议分装保存，例如分装成5μL/管，用封口膜封口，并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在≤-20℃密封避光保存。
建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
乙酰氧基甲基酯(Acetoxymethyl ester，AM)容易吸潮，从冰箱取出后，请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
第一次使用时，建议母液现配现用。且溶解后的试剂尽可能在短时间内使用，以保证实验效果。
母液遇水极易分解，若单次不能用完，建议分装保存，例如5μL/管，用封口膜封口，并严格做到≤－20℃密封干燥保存。
建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
本制品仅作科研用途！

(可选)配制Pluronic F-127母液：100mg Pluronic F-127粉末(Cat No.60318ES60)中加入0.5mL DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解过程需要在40～50℃加热20～30min。溶液室温保存，不要冷藏。如果有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。
Hanks balanced salt solution

Fluo-4,AM母液的配制：向Fluo-4,AM中加入适量DMSO，配制成1～5mM的储存液，DMSO的加入量根据Fluo-4,AM(MW1096.94)分子量进行计算(如：若配制成1mM的母液，需向50μg Fluo-4,AM中加入45.6μL DMSO)。
注：溶解用的DMSO需要保证新鲜无水，否则将会导致AM水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。
Fluo-4,AM工作液的配制：利用HBSS将Fluo-4,AM稀释成1～5μM的工作液，具体稀释方法如1mM母液配制1mL浓度为4μM工作液，用1 mLHBSS溶液稀释4μL 1mM母液即可。
注：
① 推荐该探针加载浓度在4～5μM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。
② Fluo-4,AM工作液需现配现用，避免反复冻存。
(可选)如果Fluo-4进入细胞的效果不好，可向Fluo-4,AM/DMSO溶液中加入适量20% Pluronic F-127溶液，最终稀释至其终浓度为0.04～0.05%，Pluronic F-127可以防止Fluo-4,AM在HBSS中聚合并能帮助其进入细胞。同时，可将丙磺舒(1～2mM)添加到染料工作溶液中(最终孔浓度为0.5～1mM)，以减少脱酯化指标的泄漏。
注：Pluronic F-127可降低Fluo-4,AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议将其加入储存液长期保存。
取出预培养的细胞，除去培养基，使用HBSS溶液洗涤细胞3次。
注：如果使用含血清的培养基，血清中的酯酶会分解AM基团，从而降低Fluo 4-AM进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。
将Fluo-4,AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。在37℃培养10～60min，然后除去Fluo 4-AM工作液。
注：
① 关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果：如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。
② 降低加载温度可能会减少探针AM酯运载技术造成的探针区室化。
用HBSS溶液洗涤细胞3次，以充分去除残留的Fluo 4-AM工作液。然后加入HBSS溶液覆盖细胞。
37℃培养箱孵育约20～30min，以确保AM基团在细胞内的完全去酯化作用。
注：(可选)对于含有阴离子通道蛋白的细胞，5～7步骤中可加入有机阴离子转运抑制剂probenecid(1～2.5mM)或sulfinpyrazone(0.1～0.25mM)到细胞外液以减少指示剂去酯后的渗漏。
用激光共聚焦或荧光显微镜检测细胞，激发波长494nm，发射波长516nm。
注：Fluo-4，AM进入胞内后，经酯酶降解形成Fluo-4，并不是以共价结合的形式滞留在细胞质内。因此不可对加载染料的活细胞进行固定处理，再进行Ca²⁺水平检测。

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